国産ゲノム編集技術CRISPR-Cas3が二本鎖DNAを切断する仕組みを解明 ―社会利用が可能なゲノム編集法として期待―
発表者
吉見 一人（東京大学 医科学研究所附属実験動物研究施設 先進動物ゲノム研究分野 講師）
竹下 浩平（理化学研究所 放射光科学研究センター 研究員）
古寺 哲幸（金沢大学 ナノ生命科学研究所 ナノ計測学 教授）
真下 知士（東京大学 医科学研究所附属実験動物研究施設 先進動物ゲノム研究分野 教授）
発表のポイント
- 日本発のゲノム編集技術CRISPR-Cas3が、狙ったDNA配列を認識して切断する仕組みを世界で初めて明らかにしました。
- CRISPR-Cas3は狙った場所の二本鎖DNAをほどいて片方の鎖を手繰り寄せながら、一本鎖DNAをそれぞれ別々に切ることを見出しました。高速原子間力顕微鏡を用いて、この一連の反応をリアルタイムで撮影することにも成功しました。
- 本研究成果によってCRISPR-Cas3の技術改良を進めることが可能になり、CRISPR-Cas3が安全性の高い国産ゲノム編集技術として医療応用、産業応用へ活用されることが期待されます。
発表概要
細胞内のゲノム情報を操作するためのツールとして注目される「ゲノム編集技術」は、基礎研究への利用はもちろんのこと、工業、農水産業、医療など、さまざまなライフサイエンス分野への社会実装が展開されています。
今回、東京大学医科学研究所先進動物ゲノム研究分野の吉見一人講師、真下知士教授らは、理化学研究所、金沢大学ナノ生命科学研究所の古寺哲幸教授らとの共同研究で、これまでに国産ゲノム編集技術として開発してきたCRISPR-Cas3（注１）が狙ったゲノム配列を認識して二本鎖DNAを切断する仕組みを、世界で初めて明らかにしました。従来広く使われているCRISPR-Cas9のハサミのように二本鎖DNAを同時に切る方法とは異なり、CRISPR-Cas3は二本鎖DNAをほどいて片方の鎖を手繰り寄せながら、一本鎖DNAをそれぞれ別々に切ることで、大きなDNA断片を切断していることを見出しました。またこうした一連の反応を、高速原子間力顕微鏡（高速AFM、注２）を用いて映像として撮影することに成功しました。
本研究成果によってCRISPR-Cas3の効率化や安全性の強化といった技術改良が容易になり、優れた国産ゲノム編集技術として新たな創薬や遺伝子治療などへの利用、農水産物の品種改良といった産業利用など、さまざまな分野への応用が進展することが期待されます。本研究成果は、2022年8月30日、国際科学雑誌「Nature Communications」オンライン版で公開されました。
発表内容
細胞内のゲノム情報を操作できるゲノム編集技術は、生命現象を解明するような基礎研究はもちろんのこと、工業におけるバイオ生産の効率化、農水産業における品種改良、医学分野における遺伝子治療や新規薬剤開発など、幅広い分野における活用が期待されています。これまでに発表者らは、クラス1に属する大腸菌由来CRISPR-Cas3がヒト細胞でゲノム編集できることを見出し、日本発の新しいゲノム編集技術として確立しました。CRISPR-Cas3は、世界中で利用されているCRISPR-Cas9とは異なり大きくゲノムを削る特徴を持ち、さらに認識標的配列が長いためオフターゲットへの影響も極めて低いと考えられています。そのため、安全性が高く確実に遺伝子を破壊できる国産ゲノム編集技術として医療応用、産業応用が期待されています。
ゲノム編集技術で遺伝子の変異を入れるためには、原則、狙ったゲノム部位の二本鎖DNAを両方の鎖とも切ることが必要です。CRISPR-Cas3システムは、Cascadeと呼ばれるcrRNA を含むタンパク質複合体が狙ったDNA配列を認識して結合し、そこにCas3タンパク質が結合することでDNAを切断します（図１）。このようにCas3タンパク質がDNAを切断する役目を担いますが、その機能を持つヌクレアーゼドメイン（注３）は1つしか持たず、どのように二本鎖のDNAを切断するのかはこれまで明らかにされていませんでした。
今回、東京大学医科学研究所先進動物ゲノム研究分野の吉見一人講師、真下知士教授らは、理化学研究所放射光科学研究センターの竹下浩平研究員、金沢大学ナノ生命科学研究所の古寺哲幸教授らと共に、CRISPR-Cas3システムをin vitroで再構築して特性解析を行った結果、CRISPR-Cas3のDNAを切断するメカニズムを明らかにすることに成功しました。
第一に、Cascade複合体が狙ったDNAに結合した際、Cas3は非特異的な一本鎖DNAの切断活性が生じることを見出しました。すなわち、狙った配列周辺の一本鎖DNAを非特異的に切断することが明らかになりました。この反応は「コラテラル切断」と言われています。第二に、Cas3の持つATP依存性ヘリカーゼドメイン（注４）によって一本鎖DNAが手繰り寄せられることで、標的部位の上流側で一本鎖DNAの切断が繰り返され、結果的に二本鎖切断が導入されることが明らかになりました（図１）。
さらに金沢大学が世界にさきがけて開発してきた顕微鏡技術である高速原子間力顕微鏡（高速AFM）を用いることにより、このCRISPR-Cas3のDNA配列の認識から切断までの一連の様子を動画撮影することに成功しました。特に、Cascade複合体が結合した部位の上流が「手繰り寄せ反応」によって短くなったり長くなったりする様子、さらには短くなった時に二本鎖DNAが切断される様子は世界で初めて観測されました（図２）。
本研究によりCRISPR-Cas3による狙った二本鎖DNA切断のダイナミクスが明らかになりました。大腸菌などの細菌内では、ウイルスやファージなどの外来DNAを分解・除去するために、CRISPR-Cas3のこうした一連の反応が生じていると推測され、細菌内でのCRISPR-Casシステムの一端が明らかになりました。
同時に、ヒト細胞内でゲノム編集技術として利用した場合、本反応が繰り返し生じることでDNAを大きく削り、大規模な欠失を引き起こすと考えられました。本研究により得られた動的情報は、CRISPR-Cas3を、さらなる高効率・高精度なゲノム編集技術へ発展させる上で重要かつ基盤的な知見になり、今後の改良が期待されます。
なお本研究成果は、独立行政法人日本学術振興会科学研究費基金（19K16025, 19KK0401）、科学研究費補助金（18H03974, 20H00327）、独立行政法人科学技術振興機構（JST）戦略的創造研究推進事業（CREST）（JPMJCR1762）、創薬等先端技術支援基盤プラットフォーム（JP20am0101070 (番号1251, 2463)）の支援のもと、行われました。
添付資料
図１．CRISPR-Cas3システムの二本鎖DNA切断の分子メカニズム
以下に記す順によって大規模ゲノム領域の欠失が起こると考えられる。１）Cascade複合体が標的鎖を認識、結合してR-loopを形成し、Cas3タンパク質が結合する。２）構造的に浮いている一本鎖のDNA（非標的鎖）が切断される（ニックの導入）。３）Cas3のヘリカーゼ活性により、標的配列の上流側の非標的鎖が手繰り寄せられ、削られる。４）浮いたもう一本のDNA鎖（標的鎖）がCas3のコラテラル切断活性により切断され、二本鎖とも切断される。５）本反応が繰り返し起きることで、上流側が削られる。
図２．CRISPR-Cas3による二本鎖DNAの切断
高速AFMの像。標的部位に結合したCascade-Cas3複合体（緑色）が上流の長鎖側（青色）を巻き取り、短くなった時に二本鎖切断（赤色、DSB）が導入される様子がわかる。下は長さを経時的に測定した図。
用語解説
掲載論文情報
- 論文タイトル
- Dynamic mechanisms of CRISPR interference by Escherichia coli CRISPR-Cas3
- 著者
- Kazuto Yoshimi, Kohei Takeshita, Noriyuki Kodera, Satomi Shibumura, Yuko Yamauchi, Mine Omatsu, Kenichi Umeda, Yayoi Kunihiro, Masaki Yamamoto, and Tomoji Mashimo*
- 掲載誌
- Nature Communications
- 掲載日
- 2022.08.30
- DOI
- 10.1038/s41467-022-32618-0
- URL
- https://doi.org/10.1038/s41467-022-32618-0