華山 力成

画期的なツールで紐解くエクソソームの機能

走査型イオン伝導顕微鏡によるライブイメージングでエクソソームの動態を単粒子レベルで可視化

エクソソームの魅力的な世界とその機能

「私は主に、生体内におけるエクソソームの機能について研究しています」と、華山力成教授は語る。「エクソソームとは、様々な細胞から分泌される直径30～100 nmの膜小胞で、細胞間のメッセンジャーとして働きます。私たちは、エクソソームに含まれるたんぱく質などの分子が、様々な疾患のバイオマーカーとして有用であることを発見しました」。

エクソソームには、免疫の抑制や活性化、疾患や癌の進展などに関わるタンパク質などの分子が含まれている。つまり、エクソソームは細胞機能において重要な役割を果たしているのだ。

華山教授は、エクソソームの膜表面には陰イオン性リン脂質ホスファチジルセリン（PS）が発現していること、そして、MFG-E8タンパク質およびTim4タンパク質が、その受容体として、PSを特異的に認識することを発見した。しかし、この次のステップを直接可視化した研究者はまだいない。「私たちは、バイオSPM技術を用いることで、個々のエクソソームの動態を解明することが可能になると信じています」と華山教授は語る。「エクソソーム分析のカギは、Tim4という強力なツールです」。

エクソソームの高純度精製と操作

華山教授は、Tim4がエクソソーム膜表面のPSとカルシウム依存的に結合することに着目し、Tim4を使ってエクソソームを捕捉する方法を開発した（Fig 1）。この手法により、EDTAなどのカルシウムキレート剤を加えることによって、無傷な状態でエクソソームをTim4から遊離できる。「この抽出法（PSアフィニティー法）は、富士フイルム和光純薬株式会社から製品化されており、キットとして入手できます。この技術は、日本では標準的になりつつあります」と、華山教授は説明する。

この手法では高純度のエクソソームを抽出できるため、これまで同定することができなかったエクソソーム上のタンパク質やRNAの同定が可能となった [1]。さらに、Tim4を用いたELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）のエクソソーム検出感度は、従来よりも約1,000倍の高感度を誇る（Fig 2）。

単粒子レベルでエクソソームの動態を可視化できるバイオSPM技術

華山教授は、バイオSPM技術を専門とするナノ生命科学研究所及びイギリスの研究者らと共同研究を行っている。「光学顕微鏡の分解能では、エクソソームの『集積』を観ることができますが、個々のエクソソームまでは観察できません。そこで、私たちはライブイメージングを実現できる走査型イオン伝導顕微鏡（SICM）を用いた観察技術を開発しています」と華山教授は語る。

「その第一歩として、Tim4を用いてエクソソームを捕捉し、SICMによって細胞表面のエクソソームをラベルフリーで可視化しました。次のステップは、SICMのライブイメージングによって、単粒子レベルでエクソソームの動態を可視化することです」

研究ハイライト

代表的な論文として、「細胞外小胞の新しい高純度アフィニティ精製法」 (Sci Rep) [1] と「TIM4へのアフィニティ結合を利用した細胞外小胞の高純度・高感度精製」 (Curr Protoc Cell Biol) [2]がある。

参考文献

1. W. Nakai et al, “A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles”, Sci Rep. 6:33935 (2016). doi: 10.1038/srep33935.
2. T. Yoshida et al, “High purity isolation and sensitive quantification of extracellular vesicles using affinity to TIM4”, Curr Protoc Cell Biol. 77:3.45.1-18 (2017). doi: 10.1002/cpcb.32.